背景：
慢性淋巴细胞白血病(CLL)转化为侵袭性非霍奇金淋巴瘤称为里希特综合征(Richter综合征,RS)发生在2-15%的慢性淋巴细胞白血病患者，是一种罕见的预后不良事件。使用环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松龙和利妥昔单抗(CHOP-R)进行标准治疗后，患者的总生存期为5.9至11.4个月。虽然针对B细胞受体(BCR)途径和BCL2的小分子抑制剂(SMIs)已显著改善了慢性淋巴细胞白血病患者的结局，但Richter综合征会导致小分子抑制剂失败。目前正在对重症肌无力及其组合进行调查。Richter综合征具有弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的组织学特征，但其分子特征有所不同。90%的Richter综合征与以慢性淋巴细胞白血病为原型的相关克隆具有相同的分子病变，在TP53(60-80%)、CDKN2A(30%)、MYC(30%)、NOTCH1(30%)或MGA(7%)中有突变。Richter综合征患者是患者内肿瘤异质性的典型代表。迄今为止最全面的研究使用全外显子组测序(WES)和基因组阵列，在9对慢性淋巴细胞白血病和Richter综合征中识别了新的Richter综合征驱动因子。由于缺乏种系样本，因此仅调用了在慢性淋巴细胞白血病和Richter综合征中均发生突变的基因。
我们针对DLBCL型Richter综合征的前瞻性多中心II期研究(CHOP-O)使用CHOP联合奥法木单抗，然后进行奥法木单抗维持治疗，该研究为一体化的全外显子组测序研究提供了成对的PB-CLL和Richter活检组织样本。PB-CLL代表了以慢性淋巴细胞白血病为原型的突变概况，而Richter活检组织则捕获了转化的Richter综合征的基因组复杂性。我们分析了编码和非编码单核苷酸变异体(SNVs)、小插入或缺失(InDels)和拷贝数畸变(CNAs)，并结合RNA表达谱分析(RNA-EP)来探究转化中涉及的基因和通路。我们的结果显示，新的推定转化驱动因子是进一步临床评估的可靶向候选物。
简介：
年11月18日，来自英国牛津大学的AnnaSchuh教授及其课题组在Blood(IF:17.)杂志上发表题为“GenomicandtranscriptomiccorrelatesofRichterstransformationinChronicLymphocyticLeukemia”的研究[1]。该研究对来自17例临床试验(CHOP-O)患者的配对循环慢性淋巴细胞白血病(PB-CLL)和Richter活检(Richter综合征组织)进行了全基因组测序(WGS)。旨在探索：1.Richter综合征(RS)是一种罕见的预后不良的慢性淋巴细胞白血病的并发症，也是一个迫切需要有效治疗的领域。2.对配对的慢性淋巴细胞白血病(CLL)和Richter综合征样本进行的全基因组测序(WGS)和RNA表达谱，以揭示Richter综合征转化中涉及的临床靶向基因和通路。
新发现及展望：本研究发现，在DNA损伤应答(DDR)途径中，Richter综合征组织富集了低风险慢性淋巴细胞白血病驱动因子和突变的基因。此外，研究还发现了以前与Richter综合征无关的基因组异常，包括蛋白酪氨酸磷酸酶受体(PTPRD)和肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3)。在非编码基因组中，本研究在影响关键免疫调节基因调节区的Richter综合征活检组织中发现了AID相关和不相关的卡他吉氏病(kataegis)。这些药物包括BTG2、CXCR4、NFATC1、PAX5、NOTCH-1、SLC44A5、FCRL3、SELL、TNIP2和TRIM13。此外，配对循环慢性淋巴细胞白血病和Richter综合征活检组织样本的整体突变特征之间的差异表明，DNA损伤应答是驱动转化的主要机制。基于克隆途径的去卷积分析表明，MAPK和DNA损伤应答途径中的基因表现出较高的克隆扩增概率。直接比较来自独立队列的配对循环慢性淋巴细胞白血病和Richter综合征活检组织对，通过RNA表达谱识别了相同通路的差异性表达。本研究对全基因组测序和RNA表达数据的综合分析极大地扩展了以前的靶向方法(因种系样本缺乏而受到限制)，并有助于鉴定Richter综合征转化中涉及的新基因组相关性，进而实现靶向治疗。
在预后不良的临床需求未得到满足的领域，仍存在高等级的慢性淋巴细胞白血病转化。Richter综合征的罕见性和攻击性妨碍了临床试验设计。缺乏适合的体外模型来指导合理的药物设计。Richter综合征分子结构具有高度异质性，使得基因组分析具有挑战性。
本研究对成对循环慢性淋巴细胞白血病和Richter活检组织配对的编码和非编码SNVs,InDels和CNAs进行的整合性全基因组测序分析，以及使用RNA-EP对一个独立队列进行的验证，实现了对特定基因和通路的查询，从而跟踪了Richter综合征的演变。我们的联合分析显著扩展了以前的靶向方法(其特征为缺乏种系样本、以CNV为中心和少量编码SNVs)，并揭示了许多新发现:
1.在未接受过治疗的慢性淋巴细胞白血病(TRAF3，SETD2PTPRD)中，一些很少受到外显子畸变影响的基因在Richter综合征中发生了复发突变，表明存在致病作用。蛋白酪氨酸磷酸酶受体(PTPRD)是一种与CDK2NA共定位的肿瘤抑制基因，在许多癌症中通过启动子超甲基化而沉默。蛋白酪氨酸磷酸酶受体在我们的队列中通常被删除。边缘区淋巴瘤会发生突变，但在早期慢性淋巴细胞白血病淋巴瘤和DLBCL中很少发生突变。蛋白酪氨酸磷酸酶受体和CDKN2A畸变在实体瘤中同时发生，导致STAT3通路解除调控。去甲基化药物或STAT3抑制剂的潜在治疗作用仍有待确定。我们观察到Richter综合征中信号蛋白肿瘤(肿瘤坏死因子受体相关因子3,TRAF3)缺失、失活突变和下调。肿瘤坏死因子受体相关因子3具有多种功能，包括toll样受体信号传导、泛素降解的靶向蛋白以及作为MAP-激酶和非典型NF-κB通路的负调节因子。肿瘤坏死因子受体相关因子3缺失导致NF-κB诱导激酶(NIK)过度表达。NIK抑制剂正在进入临床开发阶段。研究显示，肿瘤坏死因子受体相关因子3通过调节NF-κB途径c-MYC或与EBV潜伏膜蛋白相互作用，在正常和恶性B细胞发育中发挥关键作用。
2.与配对的循环慢性淋巴细胞白血病相比，Richter活检组织的特征是突变负荷增加，影响了大量以前在慢性淋巴细胞白血病未记录的癌症基因(BDKRB1、WWP1、TFCP2、SVIL、SLC9B1、RELN、PTK2、IRF2BP2、IL7，许多与DNA损伤应答相关)的蛋白编码区。它们在发病机制中的确切作用需要在功能研究中进一步描述。
3.这种突变负担导致非编码基因组区域出现卡他吉氏病(kataegis)。使用来自原发性慢性淋巴细胞白血病的CHROMHMM、ATAC-seq和基于连锁的注释的组合，我们能够识别连接到CXCR4和MYC的Richter活检组织的卡他吉氏病(kataegis)区域。在其他淋巴瘤中发现了这些基因编码区的获得性突变。淋巴浆细胞性淋巴瘤中的CXCR4突变赋予对伊布替尼的原发性耐药性。针对CXCR4的抗体可在体外抑制淋巴瘤进展，目前正在进行临床评估。
在B细胞中表达且具有已知免疫调节功能和/或参与B细胞恶性肿瘤的其他基因(SLC44A5、FCRL3、SELL、TNIP2、TRIM13)的启动子和增强子区域也受到卡他吉氏病的影响。
4.MAPK-RAS-ERK和DNA损伤应答通路中含有基因突变的克隆在从慢性淋巴细胞白血病向Richter综合征转化期间更可能发生扩增而非收缩，这表明存在存活优势。
在8%的慢性淋巴细胞白血病，报告有MAPK途径基因突变，在预后不良病例中增加。NOTCH1信号通路、toll样受体信号通路和DNA损伤应答通路异常在多次复发和TP53破坏的慢性淋巴细胞白血病中频繁发生。在本研究中，15例患者在随访期间出现Richter综合征。在体外用MEK抑制剂治疗原代慢性淋巴细胞白血病细胞可诱导细胞凋亡，表明其具有潜在的抗肿瘤活性。在Richter综合征中，MEK和MAPK通路抑制作用仍未得到研究。在对通路研究结果进行独立验证的过程中，使用数字RNA分析，我们证明了DNA损伤应答通路基因不仅发生突变，而且在Richter活检组织中与配对循环慢性淋巴细胞白血病相比也受到不同程度的调控。既往复发性/难治性慢性淋巴细胞白血病的全基因组测序研究显示TP53、ATM、SF3B1和NOTCH1畸变富集。TP53、ATM、CDKN2A/B损失和MYC增加的组合，收敛于与DNA损伤应答、凋亡或细胞周期控制相关的通路，是使用来自多重复发高风险慢性淋巴细胞白血病队列的在循环的慢性淋巴细胞白血病中的SNP阵列鉴定的。以前在Richter综合征中使用CN分析进行的途径分析确定了细胞周期调控失调和12三体性。此外，我们的结果显示，在Richter活检组织期，很大一部分突变特征与DNA损伤应答相关，但在配对的循环慢性淋巴细胞白血病期不相关。这些数据有力地表明，DNA损伤应答通路是药物开发的合理目标。现有的DNA损伤应答抑制剂(如PARP或ATR抑制剂)未经Richter诊断活检的检测。目前正在进行的试验检查了BTK和ATR抑制剂在高风险的慢性淋巴细胞白血病中联合使用的抑制作用。
虽然我们已经证明了将全基因组测序分析与RNA表达分析以及克隆进化的比较分析相结合的潜力，但本研究发现了三个弱点。在本研究的队列中，不可能将基因组数据与临床结果相关联，因为大多数患者的预后都很差。其次，由于需要进行严格的筛选，因此有可能将亚克隆变异体从分析中排除。在同一样本中，我们未对单个基因突变的预测效果与测定的基因表达进行直接关联。需要进行进一步的功能性研究，以阐明本研究发现对于合理选择治疗的重要性。
本研究确定了多种值得临床评估的潜在治疗靶点。下一阶段将进行适应性平台Richter综合征试验。总而言之，本研究的结果为英国临床平台研究(NCT)未来的研究药物选择提供了依据。
图1:研究概述。SNVs,InDels和CNAs是采用全基因组测序法在17例CHOP-O试验患者的配对的外周血慢性淋巴细胞白血病(PB-CLL)和Richter诊断活检组织中鉴定出的。基于这些数据，我们进行了突变负荷的综合分析、克隆结构的分析和非编码突变的分析。我们通过对来自12名Richter综合征受试者的独立队列的染色体数据进行差异基因表达和基因集富集分析，验证了我们的发现。
图6:差异表达及富集分析。A)与循环慢性淋巴细胞白血病相比，Richter活检组织中表达基因上调和下调的火山图。表达的正/负变化表示上调/下调。红点表示FDR1%时基因显著上调或下调。span=""B)通路富集分析综述。对于每种通路，本研究给出了基因表达的平均变化和95%置信区间。正/负平均值表明，在转化时，通路中基因的协同上调/下调。低于5%的FDR值表明表达的平均变化是具有显著性意义的。
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