导言
人乳头瘤病毒（HPV）基因组为8kb的游离DNA，能进行自我复制。初次感染期间，每个细胞内的HPV拷贝数增加到20-50拷贝，其基于宿主DNA复制的过程可持续激活DNA损伤反应（DDR）。HPV至少部分地通过同源重组（HR）复制其基因组。复制过程需要两种病毒蛋白：早期病毒蛋白E1和E2。E2与复制起点附近12bp的回文序列结合，并通过蛋白质相互作用募集病毒解旋酶E1。E1可形成双六聚体复合物，与宿主因子共同作用，参与病毒基因组复制。文中作者介绍了如何使用野生型及损伤的DNA模板，研究哺乳动物细胞中DNA的复制和修复。该系统有助于加深对DNA复制和修复过程中涉及的细胞组分的理解。
1.简介
HPV感染诱发了全球约5％的癌症，主要包括宫颈癌和口咽癌。HPV分为低风险（LR-HPV，不引起癌症）和高风险（HR-HPV，可引起癌症）两类，该文仅讨论HR-HPV。HPV16是最常见的HR-HPV，约50%的宫颈癌和90%的HPV阳性口咽癌由它引起。
HPV通过破损上皮感染其基底细胞，进入细胞的病毒DNA需等待宿主细胞有丝分裂后才能入核。接着，宿主因子结合病毒转录控制区（长控制区，LCR）并激活病毒基因组的转录，翻译病毒蛋白。在HPV致癌机制上，病毒早期蛋白E6主要与HECTE3泛素连接酶E6AP相互作用，结合并通过蛋白酶途径降解p53蛋白；E7可以靶向降解pRb，或结合于pRb，解除其对E2F1转录活性的抑制，激活细胞周期S期基因如cyclinE的表达。E7还调节着感染上皮细胞的分化。总而言之，E7可以刺激细胞周期，而E6可使细胞忽略这种异常增殖。E5也参与诱导了感染细胞的增殖。所有的HPV肿瘤均存在E6/E7的表达，进而驱动了被感染细胞的恶性转化。
病毒复制需要两种病毒蛋白：E1和E2。E2通过羧基末端二聚结构域形成同型二聚体，与LCR上的4个12bp回文序列结合，其中3个结合位点围绕着富含A/T的病毒复制起点。E1是一种解旋酶，通过与E2的氨基末端结构域发生蛋白质-蛋白质相互作用被招募到LCR上富含A/T的复制起点。接着，E1形成双六聚体解旋酶复合物，与宿主聚合酶和宿主因子相互作用，从而启动并完成病毒基因组的复制。
在初次感染和病毒蛋白表达之后，每个细胞的病毒基因组拷贝数增加至20-50以建立感染。感染后的基底细胞被病毒致癌基因诱导而增殖，并且被感染的细胞“向上”迁移到被感染的上皮细胞层。在此期间，病毒的生命周期处于稳定状态，单个细胞的病毒基因组拷贝数维持在20-50。进入上层的被感染上皮细胞继而进入复制激活状态，细胞内的病毒基因组拷贝得到扩增。晚期表达的结构性病毒蛋白L1和L2在此阶段开始产生，病毒基因组被这些蛋白所包裹。最后，病毒颗粒离开上皮细胞。因此，病毒的生命周期需要宿主上皮细胞的分化。
2、HPV复制和DNA损伤反应（DDR）
HPV感染会激活DNA损伤反应（DDR），这是HPV生命周期的扩增阶段所必需的。有可能HPV复制过程本身就能激活DDR。感染后，单个细胞内的病毒基因组拷贝数迅速增加至20-50，复制叉彼此“追赶”能够产生扭转应力。由于复制叉回退，扭转应力可以诱导鸡爪结构（图1）。两种机制可以解开这种结构，而不会诱导DNA双链断裂（DSB）。其一，反向分支迁移可以解开鸡爪结构，这涉及到细胞内众多因子，以及在复制叉继续以原方向复制DNA后由核酸外切酶消化鸡爪结构。第二种解开鸡爪结构并促进复制重启的机制是同源重组（HR），这一过程可能在不存在DSB的情况下在反向叉上的单链DNA(ssDNA)处发生。HPV复制利用了同源重组，以及众多与HPV基因组相互作用的同源重组因子。暂停的复制叉通过延伸ssDNA来触发DDR，激活共济失调-毛细血管扩张和RAD3相关（ataxia-telangiectasiaandRAD3-related，ATR）蛋白，并募集MRE11-RAD50-NBS1（MRN）复合物。MRN复合物可以介导同源重组和激活共济失调-毛细血管扩张突变（ataxiatelangiectasiamutated，ATM）蛋白。HPVDNA复制可以募集MRN元件。E6和E7可以破坏DDR蛋白与宿主染色质的相互作用，防止DDR的激活阻滞细胞周期。作者证明，在缺乏E6/E7表达（引入终止密码子）的和野生型的HPV16基因组中，未观察到DDR的差异，但前者的细胞生长更慢。该结果证明，在没有E6和E7的情况下，病毒复制过程有可能激活DDR；以及在活跃复制诱导DDR的情况下，E6和E7对于促进细胞增殖具有重要作用。在DDR活跃的情况下，病毒复制的进行为研究DDR存在时DNA的复制和修复提供了机会。
图1E1解旋酶由于病毒基因组复制过程中的扭转应力而暂停。这可能会导致复制叉回退，从而产生鸡爪结构。可以通过反向分支迁移或同源重组恢复复制叉，而不会引入双链DNA的断裂。
3.HPV16DNA复制分析
HPV的生命周期错综复杂，为了进行复制分析，分别构建表达E1和E2的质粒及包含病毒LCR复制起点的质粒（pOri），并将两者共同转染到C33a细胞（一种不存在HPV基因组的宫颈癌细胞系）。转染后两到三天，从细胞中收集低分子量DNA。并使用限制性酶Dpn1处理DNA。Dpn1可识别并切割DNA中甲基化的4bp序列。这种DNA甲基化发生在细菌中，而不会发生在哺乳动物细胞中。因此，在该步骤中Dpn1通过切割清除了上述低分子量DNA中的转染的质粒DNA的干扰。然后，再联合MboI可以识别并消化与Dpn1识别位点相同的非甲基化4bp序列的特性，作者建立了一种对pOri相对细胞输入DNA的复制水平进行定量分析的qPCR方法。与Southernblot相比，该方法唯一增加的步骤是核酸外切酶III（ExoIII）消化，从而降解Dpn1/MboI切割形成的DNA片段、降低PCR反应的背景。
除了定量检测DNA复制，该系统还能够检测复制保真度。作者将细菌lacZ基因整合到pOri质粒中（即pOriLac）。该质粒可以随着E1-E2共表达瞬时复制，收集低分子量DNA并用Dpn1消化。将分离出的经DNA复制产生的质粒转化到细菌中，并接种到含有选择性标记和X-gal的琼脂上。如果lacZ质粒是完整的，则会出现蓝色菌落；如果lacZ基因发生突变，则会出现白色菌落。白色菌落的增加表示突变频率增加。因此，该系统可以确定复制的水平和保真度。
图2检测E1-E2复制水平和保真度。将pOriLac与E1和E2表达质粒共转到C33a细胞中，48小时后收集低分子量DNA，并用Dpn1消化。将DNA转化到DH-10B中，并铺在X-gal琼脂上，突变频率由白色菌落的数量来指示。用Exo1处理Dpn1DNA，并通过实时qPCR测定复制水平。
4.使用HPV16复制分析法研究复制DNA的损伤
为了解有关HPV16E1-E2复制机制及其使用的宿主聚合酶的更多信息，作者研究了E1-E2使用polη的能力。为此，作者使用了着色性干皮病（XerdermaPigmentosum，XP）细胞系。用UVC照射pOriLac（图2），并将其转染到包括XP12（XPA细胞系）、XP30（XPV细胞系）和XP30polη（具有重组polη表达的XP30）在内的多种细胞系中。经过UVC处理后，所有测试的细胞系中pOriLac突变频率均大幅增加。与XP30细胞相比，XP30polη细胞中突变频率显著降低。这些结果表明E1-E2在DNA复制过程中募集了polη。作者还证明，pOriLac的病变可以在体内进行监测，由此确定在不同的遗传背景下所引入的损伤是否在体内产生了突变。
5.使用HPV16复制分析法研究宿主DNA复制和修复蛋白中的损伤
为了鉴定与E1-E2复制有关的宿主因子，作者对E2进行了酵母双杂交筛选，鉴定出TopBP1为其相互作用因子，其他研究团队也证实了TopBP1在HPV复制中的重要性。接着，作者研究团队鉴定出了调节TopBP1作为E1-E2复制的潜在调节剂的宿主酶，III类脱乙酰基酶SIRT1。SIRT可使TopBP1脱乙酰，并调节其在DNA复制中的功能，作者还证实了SIRT1除了与TopBP1结合外，它还与E1和E2蛋白结合，并且是E1-E2复制复合体的一部分。在C33a细胞中用CRISPR/Cas9编辑SIRT1，发现E1-E2复制水平提高，可能是由于E2的乙酰化水平上升和稳定性提高，此外，在SIRT1缺失的情况下复制的保真度降低（使用作者的蓝/白分析法所测量的）。作者还研究了其他已知与DNA损伤修复和复制有关的可作为SIRT1底物候选蛋白质，并最终发现WRN（Werner解旋酶）的募集发生变化。WRN编码蛋白具3→5解旋酶和3→5核酸外切酶活性，其作用涉及DNA损伤和修复的许多方面。在复制和修复中，WRN的作用是协助停滞的复制叉的维护和恢复。接下来，作者用CRISPR/Cas9编辑了C33a细胞的WRN并进行了复制测定。结果表明E1-E2复制水平提高，保真度降低，这与SIRT1敲除的表型相似。
如图1显示，WRN参与调节反向分支迁移以及停滞的复制叉的HR修复。因此，敲除WRN会降低效率或消除这些功能。在这种情况下，E1-E2复制将无法解开鸡爪结构，要继续复制，一种选择是进行断裂诱导的复制（break-inducedreplication，BIR）。使用此过程，将DSB引入停滞的分叉，从而允许从DSB重新开始复制。MUS81是一种候选核酸内切酶，会引入这种断裂。图3总结了BIR和此过程可能涉及的因素。为支持在不存在WRN的情况下从反向分支迁移和HR向BIR的转变，最近作者证明了在不存在WRN的情况下，MUS81募集到E1-E2复制DNA的显著增加。在没有WRN的情况下，FEN1核酸内切酶也具有增强的募集作用。作者利用HPV的复制系统，鉴定出了哺乳动物复制中DNA的一种修复机制。
图3不存在WRN的突变复制可能是由断裂诱导的复制驱动的。WRN耗尽会导致MUS81过量募集至复制E1-E2的DNA。MUS81的核酸内切酶功能可切割停滞的复制叉子，从而导致DNA的BIR，这是一种突变过程。
总结
这篇短评重点介绍了使用简便的E1-E2复制测定法研究哺乳动物细胞中的DNA损伤和DDR因子。并利用该系统观察到，在病毒复制过程中，HPVDNA上发生了许多表观遗传学改变，为研究DNA表观遗传学调节带来便利。
文献来源：
DasD,BristolML,PichierriP,MorganIM.UsingaHumanPapillomavirusModeltoStudyDNAReplicationandRepairofWildTypeandDamagedDNATemplatesinMammalianCells.IntJMolSci.Oct13;21(20):.doi:10./ijms2120.PMID:;PMCID:PMC.
编译：毛天皓阿卜杜
编辑：袁荻森
校对：郑立威
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