自身免疫性肝病的实验室检测及临床应用价值
自身免疫性肝病（Autoimmuneliverdisease，AILD）是以肝脏为相对特异性免疫损伤的一类自身免疫性疾病，临床常见的主要有自身免疫性肝炎（Autoimmunehepatitis，AIH）、原发性胆汁性胆管炎（Primarybiliarycholangitis，PBC）和原发性硬化性胆管炎（Primarysclerosingcholangitis，PSC）。任何两种自身免疫性肝病同时存在或任一种自身免疫性肝病重叠其它疾病，如：其它自身免疫性疾病或病毒性肝病等，可称为重叠综合征。ALD相关自身抗体的方法有多种，如间接免疫荧光法（IIFT）、酶联免疫吸附法（ELISA）、欧蒙印迹法（EUROLINE）等。临床常规检测时，建议以IIFT为筛查实验，EUROLINE或ELISA为靶抗原确认实验，联合检测应用价值更高。1.自身免疫性肝炎（AIH）自身免疫性肝炎是机体对肝细胞产生自身抗体以及自身反应性T细胞致肝脏炎症性病变。其临床特征为不同程度的血清转氨酶升高、高γ-球蛋白血症、自身抗体阳性，组织学特征为以淋巴细胞、浆细胞浸润为主的界面性肝炎，严重病例可快速进展为肝硬化和肝衰竭。本病多发于女性，男女之比为1：4，有10-30岁及40岁以上两个发病年龄高峰。大多数病人表现为慢性肝炎，约34%的患者无任何症状，仅因体检发现肝功异常而就诊；30%的患者就诊时即出现肝硬化；8%患者因呕血和（或）黑便等失代偿期肝硬化的表现而就诊；部分患者以急性、甚至暴发性起病（约占26%），其转氨酶和胆红素水平较高，临床过程凶险。约17%~48%AIH患者合并其他自身免疫性疾病，常见的有类风湿性关节炎、甲状腺炎、溃疡性结肠炎、1型糖尿病等，甚至是部分患者首次就诊的原因。
国际自身免疫性肝炎小组（IAIHG）于年发表了简化的AIH评分系统。该评分系统仅包括自身抗体、免疫球蛋白、组织学表现及除外病毒性肝炎4个项目，当其积分≥6时诊断AIH的特异性为97%，敏感性为88%；积分＞7时诊断AIH的特异性为99%，敏感性为81%。表3简化的AIH评分系统指标积分
ANA或ASMA≥1:40
1
ANA或ASMA≥1:40或LKM≥1：40或SLA阳性
2
IgG
＞正常值上限
1
＞1.1倍正常值上限
2
组织学特征
符合AIH
1
有典型的AIH表现
2
无病毒性肝炎的特征
2
确定诊断
≥6
可能诊断
≥7
1.1生化检测：AIH患者的血清AST、ALT水平常升高，ALP、γ-GT水平正常或轻度升高，伴或不伴有高胆红素血症。由于患者病情存在波动，以上指标水平变化可能较大，甚至在病程中可自行恢复正常，因此，对于AIH以上指标没有固定的诊断阈值，而且转氨酶及胆红素水平并不能反映疾病的严重程度。IgG升高及高丙种球蛋白血症是AIH的特征性改变，IgM正常或轻度升高，治疗后可恢复，IgA正常或下降，补体C4常降低，故患者就诊时应常规检测上述指标。1.2免疫学检测：AIH可以分为3个亚型，其中Ⅰ型的标志性抗体为抗核抗体（ANA）和（或）抗平滑肌抗体（ASMA），少数患者抗肝脏可溶性抗原抗体（SLA）呈阳性；Ⅱ型的标志性抗体为抗肝肾微粒体抗体（LKM-1）和抗1型肝细胞溶质抗原抗体（LC-1）阳性；Ⅲ型AIH的特征为血清抗可溶性肝抗原/肝胰抗原（SLA/LP）抗体阳性。70%-80%的AIH患者有ANA和/或SMA阳性（滴度≥1：40），3%-4%的患者可有抗肝肾微粒体抗体（Anti-LKM1）阳性，不伴有ANA和/或ASMA阳性，多见于儿童及青年患者。其他较常见的抗体还包括抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体（SLA/LP）、核周染色中性粒细胞胞浆抗体（p-ANCA）、肝无唾液酸糖蛋白受体抗体（ASGPR）、抗肝细胞溶质抗原Ⅰ型抗体（LC-1）等。部分患者自身抗体阴性，但综合其他方面可诊断为AIH。随着实验室技术的进步，部分患者可通过检测抗SLA/LP抗体及抗pANCA抗体协助明确诊断。一部分患者虽符合AIH的诊断标准，但伴有碱性磷酸酶水平明显升高（超过正常5倍以上），大多数病例经过有效免疫抑制治疗后碱性磷酸酶水平可降至正常，若其水平仍持续升高，应考虑是否存在AIH与原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎重叠综合征。酒精性肝病与AIH在实验室检查、组织学表现上有较多相似之处，可资鉴别的是：AIH以血IgG水平升高为主，而酒精性肝病以血IgA水平升高为主；酒精性肝病患者虽可出现ANA、ASMA阳性，但一般滴度较低，且很少出现抗LKM1及pANCA阳性。1.3自身免疫性肝炎（AIH）诊断标准：①血清ALT≥5×ULN；②血清IgG≥2×ULN或血清ASMA阳性；③肝组织学提示中重度界面性肝炎。2.原发性胆汁性胆管炎（PBC）PBC是一种慢性、进行性、肝内胆汁淤积性疾病，病程可以迁延数十年，多见于中老年女性，男女比例为1：9。PBC起病隐匿，早期临床表现缺乏特异性，甚至1/3的患者可长期没有临床症状，很容易被忽视，误诊率高。常见的临床表现为乏力和皮肤瘙痒，还有消化不良、肝脾肿大等；其病理特点为进行性、非化脓性、破坏性肝内小胆管炎，最终发展为肝硬化，肝移植是唯一延长生命的选择。AMA是PBC的特异性自身抗体，其识别的抗原主要是位于线粒体内膜上的丙酮酸脱氢酶复合体E2亚单位（PDC-E2）。PBC肝组织中亦可见CD4+/CD8+/PDC-E2特异性T淋巴细胞浸润。2.1生化检测：大多数PBC患者肝功能显示ALP升高，转氨酶（ALT或AST）轻度升高，免疫球蛋白（主要是IgM）升高，高水平的转氨酶（ALT或AST）可能与IgG升高相关。生化指标水平与疾病严重程度密切相关。无肝硬化患者，ALP升高程度与胆管损害和炎症程度密切相关。转氨酶活性和IgG升高主要反映汇管区小叶坏死和炎症程度，高胆红素血症反映胆管炎症和碎片状坏死的严重程度。血清胆红素、γ-球蛋白和透明质酸的增加以及血清ALB和PLT水平的下降是肝硬化和门静脉高压症的早期指标。2.2免疫学检测：PBC患者抗线粒体抗体（AMA）阳性率为95%，其主要靶抗原是丙酮酸脱氢酶复合物E2亚单位（PDC-E2）。AMA有9种亚型，与PBC密切相关的是M2、M4、M8、M9，其中M2对PBC的诊断最有意义。高滴度的AMA-M2抗体对于疾病的诊断的特异性高于95%。约50%的患者抗核抗体（ANA）和抗平滑肌抗体（SMA）阳性，5%~10%的患者（我国文献报道AMA阴性PBC患者约占15%~40%）AMA阴性或滴度≤1：80。AMA存在与否对诊断非常重要，但AMA水平与疾病严重程度无关。抗gp(抗核膜孔复合物糖蛋白抗体)和（或）抗Sp（抗可溶性酸性磷酸化核蛋白抗体）为PBC的特异性抗核抗体，可能与疾病预后相关，几乎所有AMA阴性的PBC患者都有PBC特异性抗核抗体。因此，在临床疑诊PBC但AMA抗体阴性时，可检测gp和Sp抗体以协助诊断，但肝穿刺病理活组织学检查仍是AMA抗体阴性PBC确诊的惟一手段。近期研究表明，抗KLHL12抗体和抗己糖激酶1抗体(通过蛋白质组学策略，使用高密度人重组蛋白微阵列技术对PBC患者血清进行筛选而发现的)在AMA阴性PBC中的阳性率分别为35%和22%，但该检测尚未广泛开展。2.3PBC诊断标准：①血清ALP≥2×ULN或血清GGT≥5×ULN；②血清AMA阳性；③肝组织学表现为非化脓性破坏性胆管炎。年美国肝病学会（AASLD）关于原发性胆汁性胆管炎的指南：满足下列3条标准中2条即可诊断PBC：
①血清生化提示ALP升高；
②AMA阳性，或AMA阴性时其他PBC特异性自身抗体，如Sp、gp阳性；
③组织学证据提示非化脓性破坏性胆管炎和小叶间胆管损伤。
3.原发性胆汁性胆管炎（PBC）原发性硬化性胆管炎（PSC）是一种慢性、进行性胆汁淤积性肝病，肝内外胆管闭塞性炎症和胆管纤维化导致肝硬化，最终导致肝失代偿性。PSC患者最初的主要症状是皮肤瘙痒和疲劳，通常会发生腹痛、黄疸及体重减轻，疾病晚期患者出现胆道狭窄伴发烧、寒战、肝右上象限疼痛，与细菌性胆管炎出现一致的症状。血清生化指标异常表现为ALP、转氨酶（ALT或AST）升高至正常上限的2~3倍。此外，在PSC中最常见的自身抗体为甲醛敏感的pANCA阳性（阳性率为70~80%），通常与溃疡性结肠炎相关（50~70%）。可检测出如抗核抗体（ANA）、抗心磷脂抗体（ACA）、抗甲状腺过氧化物酶抗体（TPO）、类风湿因子及抗平滑肌抗体（ASMA）等，虽然这些抗体并非肝脏特异性抗体，但暗示着潜在的免疫系统失调。
4.PBC/AIH重叠综合征患者同时或在病程的不同阶段存在两种自身免疫性肝病的临床、血清学、组织学特征，称为自身免疫性肝病重叠综合征（简称重叠综合征），以AIH-PBC重叠综合征最为多见。
年，国际自身免疫性肝炎小组(IAIHG)提出一种基于PBC和AIH主要特征的诊断方案，要求至少同时具备两种疾病的2~3个诊断指标才能诊断为PBC-AIH重叠综合征，其中组织学上表现为胆管和肝细胞损伤同时存在、中重度淋巴细胞碎屑样坏死（界面性肝炎）为诊断所必需。欧洲肝病学会（EASL）临床实践指南年版：PBC-AIH重叠综合征的诊断，要符合每种疾病诊断标准中的至少2条PBC诊断标准：（1）ALP≥2ULN／GGT≥5ULN（2）AMA-M2+（3）胆管损害AIH诊断标准：（1）ALT≥5ULN（2）IgG≥2ULNorSMA+（3）中到重度界面炎（淋巴细胞浆细胞浸润）4.2案例分析4.2.1主诉：
患者，女，44岁，因“皮肤、巩膜黄染1月余，皮肤瘙痒1周”入院。患者诉近1周来无明显诱因出现皮肤瘙痒，偶有腹痛、腹泻症状，呈中下腹阵发性绞痛，解黄色稀便，每日1-3次，量少。4.2.2现病史：
患者诉1月前受凉后服用“复方氨酚烷胺片、复方甘草合剂”等药物后，出现皮肤、巩膜黄染，伴有小便颜色深黄，无发热、寒战、出汗、皮肤瘙痒，无腹痛、腹胀、腹泻、恶心、呕吐、反酸、烧心、黑便、鲜血便等症状，-02-09医院，完善相关检查.血生化结果：ALTu/L，ASTu/L，GGTu/L，ALPu/L,TBL.6umol/L,DBL.91umol/L，CHO17.7mmol/L。B超提示：1）胆囊轮廓模糊，胆囊壁水肿；2）脾脏长，副脾。胸腹CT提示：1）肝硬化，门脉高压，脾肿大，伴肝炎可能性大；2）胆囊结石并胆囊炎；3）胰头增大，肿瘤性病变不除外；4）脾门区结节，考虑副脾；5）左侧卵巢囊肿可能；6）腹膜腔少量积液。MRCP：1）胆囊腔内条状态异常信号；2）肝大、脾稍大，伴脾门区小结节影，副脾可能；3）胰头形态饱满。胃镜提示：食管胃黏膜异位？浅表性胃炎伴糜烂；胃窦异位胰腺？诊断为“黄疸查因；肝损伤”，予护胃抑酸、保肝等对症处理（具体不详）后症状稍缓解，医院诊治。现患者及家属为求进一步诊治前来我院就诊，门诊以“慢性肝衰竭”收住院。精神尚可，饮食、睡眠欠佳，体重近1月来下降7Kg。4.2.3肝穿病理病理报告：
（肝穿活检）肝穿组织见汇管区炎症及小叶炎，小叶内见多灶坏死，周围肝细胞呈水样变性，伴淤胆及微胆栓形成，个别汇管区纤维化。炎症（inflammation）分级：G2-3，纤维化（fibrillation）分期：S1。请结合临床病史、用药史、病原学检查结果、免疫学检查结果综合考虑。4.2.4初步诊断：
1、慢性肝功能衰竭？2、肝硬化原因待查（自身免疫性肝病？酒精性肝病？）3、胆囊结石伴胆囊炎；4.2.5诊断思路：
4.2.5.1患者：女性，中年；临床表现：黄疸、瘙痒，偶有腹痛、腹泻等肝功能减退表现；4.2.5.2检验指标：白球比下降，肝酶升高，胆红素增高以直接胆红素增高为主，胆管酶学极度升高，血脂异常，抗核抗体荧光筛查实验阳性(+)，核颗粒型1:，抗Ro-+，肝炎病原学全套定性阴性；4.2.5.3影像学检查：MRCP：肝大，增强扫描未见明显异常，肝内外胆管、胆囊管、总胆管无扩张；胰头增大，增强扫描未见异常，主胰管无扩张及中断；脾稍大，副脾；门静脉增宽，管径1.5cm，门脉高压可能；胆囊炎，胆汁淤积，胆囊结石待排；4.2.5.4肝脏肿瘤、胰腺肿瘤、肝内外胆道梗阻、病毒性肝炎基本均可排除，但患者有黄疸、瘙痒、胆红素高、胆道酶学极高，有胆汁淤积生化证据，此外，自身抗体检测出抗Ro-52阳性，则肝脏自身病变引起胆汁淤积可能性大；4.2.5.5行肝穿活检：肝穿组织见汇管区炎症及小叶炎，小叶内见多灶坏死，周围肝细胞呈水样变性，伴淤胆及微胆栓形成，个别汇管区纤维化。炎症（inflammation）分级：G2-3，纤维化（fibrillation）分期：S1。4.2.5.6出院诊断：
1）重叠综合征（原发性胆汁性胆管炎与自身免疫性肝炎重叠）；2）慢性肝功能衰竭；3）自身免疫性肝病肝硬化。附：重叠综合征免疫学检查路径5.自身免疫性肝病常见自身抗体临床意义病毒性肝炎中的异常自身免疫据文献报道，乙肝与丙肝中自身抗体的阳性率大约为30-40%，其中以ANA最为多见，其次为AMA和ASMA。虽然不存在感染性肝炎是AIH的一个诊断标准，但自身抗体的出现，可能提示体内出现了由病毒诱发的自身免疫或重叠有自身免疫病（如AIH），这是如再给病人进行干扰素治疗，将加剧这种自身免疫反应，使病情恶化。因此，对病毒性肝炎，在干扰素治疗之前或治疗过程中，应定期检测自身抗体，排除自身免疫性肝病，指导临床治疗。
5.1抗核抗体（ANA）是AIH最常见的自身抗体，主要出现Ⅰ型AIH中（阳性率为75%），常与ASMA同时出现（85~90%），也可单独出现（15%),对AIH不具有诊断特异性，可见于多种结缔组织疾病和其他自身免疫性疾病。如果ANA与ASMA同时出现，高度提示AIH。5.2抗线粒体抗体（AMA）可将其靶抗原分为9型（M1-M9），迄今PBC患者血清中已发现4种类型的AMA,分别是抗M2、M4、M8、M9抗体。抗M2抗体是诊断PBC的高度特异性和敏感性指标，阳性率为94%。M2也在其它慢性肝病中（阳性率为30%）和进行性系统性硬化症（阳性率为7-25%）种也可检测到。抗M4抗体在PBC中阳性率高达55%，并且总伴有抗M2抗体阳性。单独出现抗M9抗体可能是PBC的早期阶段的指标。5.3抗平滑肌抗体（ASMA）主要出现在Ⅰ型AIH中，阳性率为40-90%，也可单独出现（35%）。在AIH中，ASMA为高滴度（1：），以IgG型为主，特异性靶抗原为F-肌动蛋白。而在其它肝脏疾病（如病毒性肝炎）和非肝脏疾病中的ASMA为低滴度，以IgM型为主，特异性靶抗原为非F-肌动蛋白。5.4抗可溶性肝抗原/肝胰抗原（SLA/LP）抗体是AIH最特异的诊断标志。虽然阳性率只有10-30%，但其阳性预告值几乎为%。如果出现相应的临床症状，每一个阳性结果基本可诊断AIH。5.5抗肝肾微粒体（LKM-1）抗体已知的抗LKM抗体的靶抗原有3型（LKM-1、LKM-2、LKM-3）。其中LKM-1为Ⅱ型AIH的标志性抗体，在AIH中阳性率为7%。5.6抗肝细胞溶质抗原1型（LC-1）抗体为Ⅱ型AIH的另一个标志性抗体，在2型AIH中阳性率为48%，特异性高达99%。在Ⅱ型AIH中既可单独出现（30-40%），也可与抗LKM-1抗体等其它抗体一起出现（60-70%）。抗LC-1抗体对AIH的特异性高于抗LKM-1抗体。5.7抗肝细胞溶质抗原Ⅰ型抗体（LC-1）抗肝细胞溶质抗原Ⅰ型抗体为Ⅱ型自身免疫性肝炎的特异性抗体，阳性率为56%～72%。多见于小于20岁的患者，大于40岁患者少见。抗肝细胞溶质抗原I型抗体水平与Ⅱ型自身免疫性肝炎患者的疾病活动性密切相关，常与抗肝肾微粒体抗体同时存在，但特异性优于抗肝肾微粒体抗体。10%的慢性丙型病毒性肝炎患者和少数Ⅰ型自身免疫性肝炎患者也可以查到抗肝细胞溶质抗原I型抗体。5.8抗Sp抗体（Sp）抗Sp抗体对PBC患者具有较高的敏感性和特异性，在PBC患者中特异性约为97%，敏感性为10%～30%，其他肝病患者均为阴性。抗Sp抗体亦少见于其他自身免疫性及风湿性疾病患者，阳性率一般3%，且阳性患者多与PBC密切相关，并在临床上常出现于肝损伤之前，如原发性干燥综合征、硬皮病等。抗Sp抗体在AMA阴性PBC患者中的阳性率为60%，显著高于AMA阳性者（20%)，该抗体对AMA阴性的PBC患者的诊断具有重要意义。此外，抗Sp抗体与PBC疾病轻重无关。5.9抗gp抗体（gp）抗gp抗体可与抗线粒体抗体（AMA）同时出现，抗线粒体抗体（AMA）是PBC高敏感性血清学指标。抗gp抗体也存在于20%～47%AMA阴性的PBC患者中，对于临床、生化和组织学表现疑似PBC而AMA阴性的患者，或AMA阳性而临床症状不典型、存在重叠综合征（如与干燥综合征重叠）的患者，抗gp抗体检测有重要价值。此外gp阳性患者肝硬化发生率明显高于阴性患者，因此该抗体阳性提示患者预后不良，抗gp抗体可作为PBC患者的预后指标。所以测定gp抗体并结合ANA荧光模式可以提高PBC的诊断率。图1：抗核点抗体（HEp-2细胞）图2：抗LSP抗体（猴肝）图3：AMA（大鼠肾脏）图4：ANA（大鼠肝脏）图5：ASMA（大鼠胃）图6：抗肌动蛋白抗体（VSM47细胞）6.医学检验科临床免疫专业组自身免疫性肝病目前开展的项目项目
检测方法
样本类型
检测时间
抗核抗体（ANA）、抗线粒体抗体（AMA）、抗平滑肌抗体（ASMA）
间接免疫荧光法（IIFT）
血清
周一至周五
抗线粒体M2抗体（AMA-M2）、抗线粒体3E抗体（AMA-3E）、抗Sp抗体（Sp）、抗gp抗体（gp）、抗肝肾微粒体抗体（LKM-1）、抗肝细胞溶质抗原Ⅰ型抗体（LC-1）、抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体（SLA/LP）、抗早幼粒细胞白血病抗体（PML）、抗Ro-52抗体（Ro-52）
欧蒙印迹法(EUROLINE)
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